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Cepas de referencia y Control de medios de cultivo (I)

El objetivo de los ensayos microbiológicos es mantener, activar, crecer, detectar o realizar recuentos de una variedad de microorganismos, para lo cual se emplean diferentes métodos de ensayo y formulaciones de medios de cultivo según sea el caso.

Los ensayos microbiológicos son fundamentales para garantizar la seguridad y calidad de los alimentos, aguas, ambientales y otros tipos de productos. Los laboratorios que realicen estas pruebas deben ofrecer resultados precisos y confiables. Por lo tanto, los medios de cultivo empleados han de ser capaces de proporcionar resultados consistentes y reproducibles.

«Los laboratorios deben garantizar que la calidad de los medios de cultivo utilizados sea la adecuada para la prueba de ensayo. Para ello, deben verificar la idoneidad de cada lote de medio de cultivo antes de su uso y durante su vida útil, debiendo cumplir los criterios de rendimiento establecidos mediante el uso de microorganismos de referencia como controles positivos y negativos trazables hasta colecciones de cultivos nacionales o internacionales reconocidas. Los medios de cultivo producidos comercialmente deben prepararse, almacenarse y utilizarse según las instrucciones del fabricante».

La norma ISO 11133 específica los requisitos para la preparación de medios de cultivo destinados al análisis microbiológico de alimentos, aguas y ambiental. Dichos requisitos son aplicables a todas las categorías de medios de cultivo empleados en los análisis microbiológicos.

La norma internacional también establece criterios y describe métodos para los ensayos de rendimiento de los medios de cultivo según el método de ensayo y cepas de referencia de aplicación.

La norma internacional aplica a fabricantes tales como:

Entidades comerciales que producen y/o distribuyen medios deshidratados o reconstituidos semi-acabados o listos para su uso.
Entidades no comerciales que proporcionan medios a tercero
Laboratorios microbiológicos que preparan medios de cultivo para uso propio

El uso de cepas de referencia y el control de calidad de los medios de cultivo se centran en los requisitos de la norma ISO/IEC 17025; siendo de aplicación también para las organizaciones que buscan la acreditación o certificación según los requisitos de normas como ISO 15189, BPL (Buenas Prácticas de Laboratorio), BPF (Buenas Prácticas de Fabricación) y BPC (Buenas Prácticas Clínicas).

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Microorganismos de referencia y control de medios de cultivo y diluyentes (II)

El objetivo principal de los laboratorios que realizan exámenes microbiológicos es el mantener, activar, crecer, detectar o recontar microorganismos diana mediante el uso de medios de cultivo y diluyentes.

Importancia del control de calidad de medios.

La verificación de la calidad y conformidad de los medios de cultivo y diluyentes a emplear en los métodos de ensayo, es un aspecto clave para la obtención de resultados reproducibles y consistentes.
Entre los parámetros de calidad, se evalúa el rendimiento frente a microorganismos de referencia empleados, siendo satisfactorio cuando se comportan de acuerdo a unas especificaciones establecidas (ej. ISO 11133)

Clasificación de medios

Los medios de cultivo se clasifican según su composición, consistencia física, uso y preparación

Tipos de medios disponibles

Los medios de cultivo y diluyentes empleados por el laboratorio han de ser específicos para el tipo de muestra y microorganismos a detectar.

Según su preparación, los tipos de medios a emplear pueden ser:

✔ Medios listos para su uso

✔ Medios preparados a partir de formulas deshidratadas

✔ Medios preparados a partir de componentes individules

Aspectos a tener en cuenta para su preparación

Para su preparación, almacenamiento y uso se han de tener en cuenta las buenas prácticas de laboratorio (BPL), las instrucciones del fabricante y normas de referencia (ej. ISO 11133)

En determinados medios de cultivo se tendrá en cuenta la preparación y adición de suplementos

Garantía de calidad

Los medios de cultivo y diluyentes una vez preparados han de someterse a controles de:
✔ esterilidad (ausencia de contaminación),
✔ físico-químicos (pH, apariencia, color, consistencia,..),
✔ macroscópicos (grosor de medio, uniformidad, retracción..) y
✔ rendimiento (control con microorganismos de referencia)

Los resultados obtenidos han de cumplir las especificaciones del fabricantes y normas de referencia (ej. ISO 11133)
El laboratorio debe realizar un análisis de causas de las desviaciones presentadas durante la preparación de medios y llevar a cabo las acciones correctivas necesarias.

Microorganismos de referencia. Requisitos

Para medios de cultivo, diluyentes y reactivos empleados en aguas y alimentos (normas ISO), se tienen en cuenta las cepas de referencia incluidas en el catálogo WDCM (https://refs.wdcm.org/) y el listado publicado por el grupo de trabajo ISO/TC 34/SC9.

Para otros campos de trabajo (ej. cosmética y productos farmacéuticos), se tendrán en cuenta las correspondientes indicaciones en los documentos normativos de aplicación (ej. normas ISO y farmacopeas)

Proveedores de microorganismos de referencia

Los microorganismos de referencia se obtienen a directamente de las colecciones de cultivo tipo (ej. CECT, ATTCC,..) o de proveedores certificados (ej. ISO 9001)

Formas disponibles de microorganismos de referencia

Según su preparación, homogeneidad, estabilidad, rango de ufc y soporte, se pueden obtener como:
A. Cepa de referencia (ej.cultivos activos, Liofilizados)
B. Material de referencia (MR). Material homogéneo.
C. Material de referencia certificado (MRC). Material con valor medio de ufc e incertidunbre declarada. (ej, lenticulas, biobolas)

Utilización

Los microorganismos de referencia A y B, serán utilizados para la obtención de lote de reserva de referencia, cultivo de reserva y cultivo de trabajo, del cual, se obtendrá la suspension de trabajo (inóculo)
Los microorganismos de referencia del tipo C, se podrán utilizar directamente o previa dilución, como suspension de trabajo (inóculo)

Rendimiento de un medio

El rendimiento de un medio nos indica si todos los microorganismos de ensayo utilizados se comportan conforme a las especificaciones establecidas, en caso de conformidad, el rendimiento sería satisfactorio.

Realización del ensayo de rendimiento

El ensayo de rendimiento se realiza teniendo en cuenta;

✔ la naturaleza del ensayo donde se vayan a emplear los medios de cultivo (cuantitativo o cualitativo),

✔ tipo de medio de cultivo (sólido, semisólido o líquido) y

✔ la carga de inóculo y tipo de siembra a emplear según el tipo de prueba (productividad, especificidad, selectividad)

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Verificación de métodos de referencia y métodos alternativos validados (II)

La serie de la norma ISO 16140 se ha visto ampliada en 6 partes dada la necesidad de abordar las diferentes vías de validación o verificación de los métodos de ensayo, dar cumplimiento a la norma ISO/IEC 17025 (7.2.1.5) y armonización de criterios.

ISO 16140/ UNE-EN ISO 16140 «Microbiología de la cadena alimentaria -Validación del método»:
Parte 1: Vocabulario
Parte 2: Protocolo para la validación de métodos alternativos (registrados) con respecto a un método de referencia
Parte 3: Protocolo para la verificación en un único laboratorio de métodos de referencia y métodos alternativos validados
Parte 4: Protocolo para la validación del método en un único laboratorio
Parte 5: Protocolo para la validación factorial interlaboratorio para métodos no propietarios
Parte 6: Protocolo para la validación de métodos alternativos (registrados) de confirmación microbiológica y procedimientos de tipado microbiológico.

¿Por qué se ha de realizar una verificación de los métodos?

la norma ISO/IEC 17025 establece lo siguiente al respecto:

ISO/IEC 17025 (7.2.1.5) “ El laboratorio debe verificar que puede llevar a cabo apropiadamente los métodos antes de utilizarlos, asegurando que pueda lograr el desempeño requerido. Se deben conservar registros de la verificación. Sí el método es modificado por el organismo que lo público, la verificación se debe repetir , en la extensión necesaria”

¿Qué métodos pueden ser verificados?

La norma ISO 17468. «Requisitos técnicos y recomendaciones para el desarrollo o la revisión de métodos de referencia normalizados», establece 2 etapas antes de que un método pueda ser utilizado en un laboratorio.

Etapa 1. Validación del método. Estudio realizado en un laboratorio seguido de un estudio de intercomparación (ISO 16140-2, 16140-5, ISO 16140-6). En el caso de métodos validados en un único laboratorio (ISO 16140-4), estos no son seguidos de un estudio de intercomparación

Etapa 2. Verificación del método (ISO 16140-3). Estudio cuya finalidad es demostrar que el laboratorio es capaz de implementar el método validado de manera satisfactoria. La verificación se aplica solo a métodos que han sido validados seguidos de un estudio de intercomparación (ISO 17468, ISO 16140-2, 16140-5, ISO 16140-6)

ISO 16140-3:2021

La norma ISO 16140-3:2021, tiene como objeto la verificación de métodos de referencia y métodos alternativos validados para su implementación en los laboratorios de ensayo. Es de aplicación a la verificación de métodos utilizados para el análisis (detección/cuantificación), confirmación y tipificación de microorganismos presentes en:

✔ Productos destinados al consumo humano
✔ Productos destinados al consumo animal
✔ Muestras ambientales de áreas de producción y manipulación de productos alimentarios para consumo humano o animal.
✔ Muestras procedentes de producción primaria.

El estudio de verificación lo podemos abordar en 3 etapas (Figura 1):

Etapa 1 Seleccionar el método de ensayo a validar (cualitativo/cuantitativo) y definir su alcance de aplicación del laboratorio (categorías, tipos y matrices).

Etapa 2. Evaluar el alcance del método (referencia, alternativo), alcance de validación del método (ej, Afnor, AOAC, otros) y alcance de aplicación del método en el laboratorio.

Seleccionar un número y tipo de muestras a verificar según el alcance (rango) de aplicación del método en el laboratorio (limitado, amplio o amplio + otras categorías).

Etapa 3. Realizar etapas de verificación

3.1. Verificación de implementación. El propósito de esta etapa es demostrar que el laboratorio es capaz de realizar (implementar) el método validado de manera correcta.

✔ Parámetro cualitativo a evaluar: Límite de Detección estimado (eLOD₅₀) según protocolos definidos en la norma.
✔ Parámetro cuantitativo a evaluar: Desviación Estándar de Reproducibilidad Intralaboratorio (S_IR)

3.2. Verificación de matrices alimentarias. El propósito de esta etapa es demostrar que el laboratorio es capaz de analizar correctamente los alimentos (matrices) que declara en su alcance de aplicación. El laboratorio seleccionará alimentos que se analizan habitualmente en el laboratorio, incluyendo los de mayor dificultad.

✔ Parámetro cualitativo a evaluar: Límite de Detección estimado (eLOD₅₀) según protocolos definidos en la norma.
✔ Parámetro cuantitativo a evaluar: Sesgo o Bias estimado (eBias)

Nota: Para los tres niveles de alcance (rangos), etapas y parámetros de verificación, la norma detalla las condiciones, el número de repeticiones que deben hacerse y el número de alimentos a emplear.

Resultados. Obtenidos los valores de desempeño cualitativos y/o cuantitativos, son evaluados frente a los correspondientes criterios de aceptación incluidos en los diferentes apartados de la norma.

En el apartado 7, la norma aborda el protocolo de verificación de métodos de confirmación y tipificación validados, mediante estudios de inclusividad y exclusividad.

En el anexo F, la norma incluye el protocolo de verificación en un único laboratorio de métodos de referencia no validados.

Figura 1. Etapas de verificación

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Curso C02. Verificación de métodos microbiológicos de referencia y alternativos validados. Alimentos (ISO 16140-3) Más información

Calibraciones internas

📢Calibraciones internas!!!

Cargado viene el mes de otoño!!

Repasamos la reciente documentación de ENAC en relación a la «Evaluación de análisis de riesgos y participación en ensayos de aptitud de actividades de calibración interna».

👉NT-03.Rev.10. Septiembre de 2023. Política de ENAC sobre Intercomparaciones.

7.2. Calibraciones internas y ensayos en apoyo a otras actividades acreditadas.

Las entidades deben disponer de un plan de participación en ensayos de aptitud y otras intercomparaciones de sus calibraciones internas relevantes que deberá basarse en el riesgo, teniendo en cuenta el contexto específico y la actividad realizada, así como la existencia de otros medios de aseguramiento de la validez de los resultados que el laboratorio pueda tener a su disposición (ver cláusula 7.7.1 de la norma) que puedan demostrar la validez de las calibraciones internas.

🚩Nota: Las entidades acreditadas deberán disponer de este plan antes de septiembre de 2024!!

👉G-ENAC-25 Rev.1. Octubre 2023. Guía para el desarrollo de análisis de riesgos en relación con la participación en ejercicios de aptitud para calibraciones internas.

Por tanto, los laboratorios acreditados o que desean acreditarse deben disponer de planes de participación en intercomparaciones para la actividad de calibración interna en función de la magnitud de los riesgos que provocarían no desarrollarlos de acuerdo con lo indicado en el documento.

Así, el objeto de esta guía es establecer pautas y modelos para que los laboratorios puedan evaluar y valorar sus riesgos de cara al desarrollo del citado plan.

Su alcance se extiende a todos los laboratorios que desarrollan algún tipo de calibración interna, pero podría ser utilizado por cualquier organización que desarrolle calibraciones internas dado que su referencia para esta actividad debe ser la ISO/IEC 17025 tal y como se indica en el punto 3, apartado 1 de la NT 74 de ENAC.

Enlaces de referencias.

NT-03.Rev.10. Septiembre de 2023. Política de ENAC sobre Intercomparaciones.

G-ENAC-25 Rev.1. Octubre 2023. Guía para el desarrollo de análisis de riesgos en relación con la participación en ejercicios de aptitud para calibraciones internas.